style="width:3.09994in" />GB/T 34168—2017 本文是学习GB-T 34168-2017 金、银纳米颗粒材料生物效应的透射电子显微镜检测方法. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了用透射电子显微镜(以下简称透射电镜)检测含有金、银纳米颗粒材料的生物试样超
微结构的技术和规范。
本标准规定的各项准则，主要适用于透射电子显微镜对金、银纳米材料的生物效应检测分析。
下列术语和定义适用于本文件。
2.1
金、银纳米颗粒 gold and silver nanoparticle
尺度小于100 nm 的 Au、Ag 颗粒。
2.2
金、银纳米颗粒团聚体 gold and silver nanoparticle
coacervate
处于团聚态的 Au、Ag 纳米颗粒。
2.3
生物效应 biological effect
生命过程因纳米材料的介入而产生的生理功能、生化功能及形态结构的变化。
2.4
生物效应检测 biological effect test
采用生物学、物理学、化学、毒理学与医学等领域的实验技术对纳米材料的生物效应进行检验测量。
2.5
生物薄试样 thin biological sample
生物薄试样是指制备成适宜于透射电镜观察的生物试样，厚度通常为100 nm
以下。
金、银纳米颗粒的表面理化特性使其在常态下处于团聚态，而团聚的金、银纳米颗粒材料尺度并不
全是纳米级，需采用物理或化学法将其分散成具有纳米尺度的颗粒。经分散后的金、银纳米颗粒与生物
体接触，进行其生物效应研究。与金、银纳米颗粒接触后的生物体，需采用生物组织或细胞的超微结构
制样方法，将其制成生物薄试样，然后在透射电镜下检测金、银纳米颗粒作用于生物体后引发的细胞及
细胞器的超微结构变化，以确定金、银纳米颗粒的生物效应。
GB/T 34168—2017
4.1.8 恒温烘箱(30℃~70℃)。
4.3.1.1 电源电压及频率应稳定(220±22
4.3.1.2 电镜室相对湿度小于60%。
4.3.1.3 电镜室温度(20±5
4.3.1.4
具备仪器专用地线，接地电阻值参照仪器说明书的要求。
4.3.2.1 切片室应为超薄切片专用房间。
4.3.2.2 切片室相对湿度小于60%。
4.3.2.3 切片室温度(20±5
4.3.2.4 电源电压(220±22
根据生物效应检测的要求，将金、银纳米颗粒材料与细胞培养基或0.9%(9 g/L)
生理盐水(NaCl 水
溶液)按所需的比例充分混和，涡旋振荡3 min 后，再放入超声波清洗仪中分散。
注：建议分散的条件：水温25℃~30℃;超声波功率300 W; 频率(40±4)kHz;
超声分散3次，每次时间10 min。
5.2.1
将已分散、不同浓度的金、银纳米颗粒悬液滴在覆有支持膜(一般用火棉胶或
Formvar 膜)的透
射电镜专用载网上，也可用微栅。
GB/T 34168—2017
5.2.2 将滴有金、银纳米颗粒悬液的电镜专用载网放入恒温烘箱中，60℃烘烤2 h。
5.3 含有金、银纳米颗粒的生物组织(简称生物组织)
5.3.1 取材：将生物组织在固定液(4℃)中迅速切成小于1mm³ 的小块。
5.3.2 前固定：将1 mm³
的生物组织浸泡在20倍体积、4℃的2%或3%(体积分数)戊二醛固定液中 固 定 1
h～4 h。 配制戊二醛固定液可参考附录 A。
5.3.3 漂洗：用磷酸缓冲液充分漂洗。配制磷酸缓冲液可参考附录 B。
5.3.4 后固定：将1 mm³ 的生物组织浸泡在1%(10 g/L) 锇酸固定液中，4℃固定2
h。 配置四氧化锇
固定液可参考附录 C。
5.3.5
脱水：用乙醇和丙酮梯度脱水。建议乙醇和丙酮梯度脱水的顺序为：30%、50%、70%、90%(体
积分数)乙醇各一次；90%(体积分数)丙酮1次；100%(体积分数)丙酮3次；每次10
min～15 min。
5.3.6 浸透与包埋：在按比例配制好的环氧树脂 Epon812
包埋剂中浸透后，在胶囊(或硅胶包埋板)内
进行包埋。建议浸透顺序为，丙酮：包埋剂(浸透时间):1:1(1 h～2h);1:2(12h);
纯包埋剂(1 h)。 环氧树脂 Epon812 包埋剂配制比例可参考附录 D 的表 D.1。
5.3.7 聚合：在恒温烘箱内按以下顺序进行聚合，37℃保持12 h;60℃ 保持36
h,形成包埋块。
5.3.8
修块与定位：包埋块在进行超薄切片之前，将分析部位修成易于超薄切片的形状。
5.3.9
超薄切片：采用超薄切片机将已修好的包埋块切成超薄切片，厚度一般要求在50
nm～100 nm。
5.3.10
染色：采用醋酸双氧铀和柠檬酸铅对超薄切片进行双重金属染色后待检。
5.3.11 用 于X 射线能谱仪分析的生物薄试样，不能进行染色。
注：生物组织：通过呼吸道吸入、消化道摄入或注射、植入、细胞培养等方法使金、银纳米颗粒进入生物细胞或组织。
5.4.1
前固定：用橡皮刮将细胞从培养皿底部刮下或采用胰酶消化下来，低速离心(800g,5
min)成小 团块，弃上清液，沿管壁加入2%(体积分数)戊二醛和2%(20 g/L)
多聚甲醛混合固定液，吹散，放入 4 ℃ 冰 箱 1 h～4 h。
5.4.2 细胞凝块：将细胞用磷酸缓冲液漂洗3次，每次5 min,
离心后加入血浆，使细胞与血浆混匀后离
心，弃上清，沿管壁加入3%戊二醛固定液，放入4℃冰箱12
h,形成细胞凝块，然后将细胞凝块切成小 于1 mm³ 的小块。
5.4.3 用磷酸缓冲液充分漂洗。
5.4.4 后固定：将充分漂洗后的细胞团块浸没于1%(10 g/L)
锇酸，放入4℃冰箱2 h。
5.4.6 浸透与包埋(同5.3.6)。
5.4.8 修块(同5.3.8)。
5.4.9 超薄切片(同5.3.9)。
5.4.10 染色(同5.3.10)。
5.4.11 用于X 射线能谱仪分析的生物薄试样，不能进行染色。
6.1.1.1
开机，抽真空至电镜正常工作所需的高真空后再稳定30 min 以上。
GB/T 34168—2017
6.1.1.2
选择测试生物薄试样所需的加速电压，建议检测生物薄试样所需的加速电压选择在60
kV~
6.1.1.3
调节电子枪的灯丝电流，使束流处于稳定饱和状态。
6.1.1.4
对电子光学系统进行对中调整，尽可能消除聚光镜象散和物镜象散，使透射电镜处于最佳工作
状态。
参照 GB/T 18873
6.2.1.1
将已分散及干燥的金或银纳米颗粒薄试样放入透射电镜。
6.2.1.2
在低倍(3000倍～4000倍)下寻找合适的试样部位，要求被分析试样区无破损、无污染。
6.2.1.3
在高倍(30000倍～50000倍左右)时观察金、银纳米颗粒的分散情况，测量金、银纳米颗粒的
尺寸并记录图像
6.2.2 含有金、银纳米颗粒的生物薄试样
6.2.2.1
在低倍(小于4000倍)下寻找合适的生物薄试样部位，要求被分析试样区无破损、无污染、无
震颤条纹。
6.2.2.2 将确定的试样区置于透射电镜的观察中心。
6.2.2.3
逐步增加放大倍数(一般放大倍数在10000倍～30000倍即可，少数需放大30000倍以上),
寻找细胞内外、细胞器内外有无金、银纳米颗粒。
6.2.2.4 分析金、银纳米颗粒分布的位置，建议采用 X
射线能谱仪分析对金、银纳米颗粒进行定性分 析，分析方法可参考 GB/T 18873。
6.2.2.5
注意区分样品制备过程中引入的污染颗粒物和金、银纳米颗粒。无法判别时，必须采用X
射
线能谱仪分析对污染颗粒及金、银纳米颗粒进行定性鉴别分析，分析方法可参考
GB/T 18873。
6.2.2.6 消像散、聚焦后记录图像。
分析结果报告可参照GB/T 27025,应包括以下信息：
a) 分析报告的唯一编号；
b) 试样名称；
c) 送样人姓名，单位和地址；
d) 试样的接收日期；
e) 分析仪器及其工作条件；
f) 分析结果和必要的说明；
g) 检测人签字；
h) 分析报告负责人的签字；
i) 分析报告的页码；
j) 发布分析报告的实验室名称和地址；
k) 分析报告的日期。
GB/T 34168—2017
(资料性附录)
戊二醛固定液配制
A.1 配制2.0%戊二醛固定液(磷酸缓冲液，pH 7.3):
量取0.2 mol/L 磷酸缓冲液(pH7.3)50 mL,加入纯化的25%戊二醛水溶液8 mL,
最后用双蒸水
定容至100 mL。 充分混匀。
A.2 配制3.0%戊二醛固定液(磷酸缓冲液，pH 7.3):
量取0.2 mol/L 磷酸缓冲液(pH7.3)50mL, 加入纯化的25%戊二醛水溶液12 mL,
最后用双蒸水
定容至100 mL。 充分混匀。
注： 戊二醛固定液宜现配现用。
GB/T 34168—2017
(资料性附录)
磷酸缓冲液配制
B.1 配制0.2 mol/L 磷酸缓冲液(Sorensen 配方)
A 液 0.2 mol/L 磷酸二氢钠水溶液：
NaH₂PO₄ ·H₂O
或 NaH₂PO₄ ·2H₂O
加双蒸水到1000 mL, 混匀。
B 液 0.2 mol/L 磷酸氢二钠水溶液：
Na₂HPO₄ ·2H₂O
或 Na₂HPO₁ · 12H₂O
加双蒸水到1000 mL, 混匀。
按表 B.1 量取A 液和B 液混合后，测 pH。
35.61
71.64
表 B.1 0.2 mol/L磷酸缓冲液配方参考表
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B.2 配制0.1 mol/L 磷酸缓冲液
量取0.2 mol/L 磷酸缓冲液100 mL, 加入双蒸水100 mL, 混匀，测 pH。
GB/T 34168—2017
(资料性附录)
四氧化锇固定液配制
C.1 配制2%四氧化锇贮存液
将装有四氧化锇的安瓿(共2
g)洗净，用玻璃划割器刻痕，再用双蒸水冲洗几次，放入洁净棕色广口
玻璃瓶内，加100 mL
双蒸水，用洁净玻璃棒捣破安瓿。然后用封口膜将广口玻璃封口，贴上标签，置于
干燥器中，4℃保存备用。
C.2 配制1%四氧化锇固定液(磷酸缓冲液，pH7.3)
等量0.2 mol/L 磷酸缓冲液(pH7.3) 与2%四氧化锇贮存液混合，现配现用。
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(资料性附录)
环氧树脂 Epon812 包埋剂配制
环氧树脂 Epon812 包埋剂配制参见表D.1。
表 D.1 环氧树脂 Epon812 包埋剂配制比例参考表
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|---|---|---|---|---|
| 5 g |
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0.16 mL | 10 mL |
| 10 g | 6 g | 4 g | 0.32 mL | 20 mL |
| 15 g | 9 g | 6 g | 0.48 mL | 30 mL |
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